È uno dei più antichi musei ecclesiastici, essendo stato fondato nel 1859, nel quale si possono ammirare alcuni autentici capolavori dell'arte toscana dei secoli XIV-XVI.
Dal suggestivo Battistero, dove sono riuniti tutti gli affreschi (tra i quali il capolavoro di Masolino raffigurante Cristo in pietà) e per cui fu scolpito anche l'imponente fonte battesimale attribuito a Bernardo Rossellino, si passa nella seconda sala destinata alle sculture (Tino di Camaino, Mino da Fiesole).
La Pinacoteca è allestita al piano superiore, dove i dipinti sono disposti cronologicamente: dal polittico dell'anonimo artista pistoiese denominato Maestro del 1336 agli interessanti prodotti delle botteghe fiorentine, operose tra la fine del XIV e gli inizi del XV secolo. Seguono in un'altra sala le opere già pienamente quattrocentesche, con autentici capolavori quali i due trittici di Lorenzo Monaco e la piccola Maestà di Filippo Lippi. La sala successiva, accanto al Tabernacolo di San Sebastiano ai Francesco Botticini e Antonio Rossellino, riunisce tutte le opere dei Botticini, la cui bottega fu attiva fino ai primi decenni del Cinquecento. Nel salone domina il Tabernacolo del Sacramento di Francesco e Raffaello Botticini; seguono infine altre opere tardo-quattrocentesche, cinquecentesche e quelle già seicentesche.
Il percorso del Museo si conclude nella parte superiore del chiostro, dove sono esposte alcune robbiane.

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